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1. 颈椎脱臼法处死SD大鼠。

2. 剃去背毛，75%酒精浸泡5min。

3. 从尾椎处剪开皮肤，取出腰椎。

4. 尽量剔除附着的肌肉，用含2%双抗的PBS冲洗3-5次。

5. 分离椎节，切开纤维环分离凝胶状髓核，将凝胶状髓核置于PBS中冲洗 3 次，去除血迹，剪碎髓核组织呈 1mm³大小，移至离心管后加入5倍体积的1.5%Ⅱ型胶原酶，37℃摇床消化2h。

6. 消化结束 ，20%FBS终止消化，100um滤网过滤，1000r/min 离心 5min，弃上清后DMEM/F12 重悬，按 1×10⁵ /ml接种于培养板，加入含1%双抗和 15% FBS 的 DMEM/F12，置于 37 ℃细胞培养箱中培养。

7. 4 d后首次换液，以后每3天换换液 1 次，细胞达 90% 融合后传代